制備DLIN-MC3脂質納米顆粒

　　實驗目的：

　　分別以DLIN-MC3為陽離子主要脂質，參照文獻方法制備包載mRNA的LNP。

　　實驗原理：

　　DLIN-MC3是可解離脂質，在酸性條件下可質子化形成陽離子脂質，通過靜電作用于帶負電的mRNA結合，形成載有mRNA的脂質納米顆粒(lipid nanoparticles,LNPs)。常見的制備方法有薄膜-水化法、溶劑注入法、高壓均質法和微流控法等方法，在本實驗中采用微流控法，讓脂質溶液與和mRNA溶液在微混合器中充分、迅速的混合，形成粒徑均一的LNP。由于脂質溶解于乙醇中，核酸溶解于酸性緩沖液中，因此需要透析去除殘余的乙醇并換液至PBS。

　　實驗材料：

　　DLIN-MC3、DSPC、DMG-PEG2000、冰醋酸、三水醋酸鈉

　　實驗步驟：

　　1、 配置脂質乙醇溶液：

　　　　a) LNP 的成分與分子量見下表：

　　百分比來源于前期研究，并不一定與 onpattro 和 mRNA-1273 相同。

　　　　b)每種成分別配置三個濃度：8 mM（約5 mg/ml）、12 mM（約7.5 mg/ml）和16 mM（約10 mg/ml）。

　　2、 計算 mRNA 濃度：

　　　　a) 根據 N/P=6，FRR=3 計算所需 RNA 濃度。

　　　　b) RNA 的堿基的平均分子量為340，每個堿基攜帶1 個磷酸，因此RNA 中的含磷量為3.1 nmol/μg.

　　　　c) 計算氮磷比時僅計算主要脂質中的氮原子數，因此每摩爾混合脂質中含有 0.5 摩爾 N。

　　3、 配置 mRNA-醋酸緩沖液：

　　　　稱取3.2g三水醋酸鈉，8ml冰醋酸，定容于1000ml。加入相應梯度的mRNA

　　4、 微流控混合：

　　　　a. 將脂質-乙醇溶液過 0.22 μm 疏水聚四氟乙烯膜，mRNA-檸檬酸緩沖液過 0.22 μm 親水聚四氟乙烯膜，過膜后裝入微量注射器中。

　　　　b. 以FRR=3 ，磷脂和緩沖液以0.2ml/min和0.6ml/min，通過nexstarnano1芯片，混合。

　　5、 透析與儲存：

　　　　a) 制備后放入透析管（Slide-A-Lyzer™ MINI Dialysis Device, 10K MWCO, 0.5 mL）中加入 14 ml PBS在搖床上透析，2 小時后換液，直至 18 小時后透析結束。

　　　　b) 保存于 4℃待用。

實驗名稱：LNP 包封率測定

　　實驗目的：

　　　　對制備的 LNP 包封 mRNA 的效果進行測定

　　實驗原理：

　　　　Quant-iT™RiboGreen®RNA 試劑是一種超靈敏的熒光核酸染色劑，可檢測溶液中 1-200 ng 的核酸，這種核酸染料無法透過 LNP，因此只有游離的未被 LNP 包載的核酸可以被結合。Triton-100 作為一種表面活性劑常被用做破乳劑，使用 1%的 Triton-100 處理獲得的 LNP-mRNA 可以使包載的核酸釋放，得到總核酸量。通過計算破乳前后核酸量的差異得到載藥量，再除以總核酸量即可得到包封率，即：

包封率（%）=（破乳后定量-破乳前定量）/破乳后定量

　　實驗材料：

　　　　Quant-iT ™ RiboGreen ™ RNA   檢 測 試 劑 盒 （ Thermo  Fisher ， R11490 ）、 Triton ™ X-100

　　　　（SIGMA-ALDRICH，T8787-100ML）、DEPC 水、CellCarrier-96 Ultra Microplates  （ PerkinElmer，6055308）、 LNP-mRNA

　　實驗步驟：

　　　　1. LNP 制備：

　　　　　　見 LNP 制備流程。

　　　　2. 試劑準備（詳細參見說明書）：

　　　　　　將 20xTE 用 DEPC 水稀釋至 1x；

　　　　　　用稀釋好的 1XTE 稀釋試劑盒中的標準品，稀釋成 2 μg/mL 及 100 ng/mL 兩種終濃度；

　　　　　　用 1xTE 稀釋試劑盒中的 QuantiT™ RiboGreen® Reagen，稀釋成 200 倍及 2000 倍兩種終濃度； 按照下表在 CellCarrier-96 Ultra Microplates 中加入以下試劑，做復孔：

High range

Low range

1. LNP 破乳

將 Triton-100 用 1xTE 稀釋到 2%，取 100 μl 加入 CellCarrier-96 Ultra Microplates，加入 1 μl 制備好的

LNP，處理 5 分鐘，加入 100 μl 200-fold diluted quant-iT RiboGreen Reagent。

2. LNP 游離核酸測定

在 CellCarrier-96 Ultra Microplates 中加入 100ul1xTE，取 1μl 制備好的 LNP 加進去，混勻，加入 100 μl l2000-fold diluted quant-iT RiboGreen Reagent。

3. 讀板

使用 SPARK 讀取熒光強度，激發光設置為 480 nm，發射光為 520 nm

4. 數據處理

1） 標曲制備

High range	Low range

2) 樣品定量

載藥量=破乳后讀值-破乳前讀值包封率（%）=載藥量/破乳后讀值